view in publisher's site

DNA-, RNA-, and Protein-Based Stable-Isotope Probing for High-Throughput Biomarker Analysis of Active Microorganisms

Stable-isotope probing (SIP) enables researchers to target active populations within complex microbial communities, which is achieved by providing growth substrates enriched in heavy isotopes, usually in the form of 13C, 18O, or 15N. After growth on the substrate and subsequent extraction of microbial biomarkers, typically nucleic acids or proteins, the SIP technique is used for the recovery and analysis of isotope-labeled biomarkers from active microbial populations. In the years following the initial development of DNA- and RNA-based SIP, it was common practice to characterize labeled populations by targeted gene analysis. Such approaches usually involved fingerprint-based analyses or sequencing of clone libraries containing 16S rRNA genes or functional marker gene amplicons. Although molecular fingerprinting remains a valuable approach for rapid confirmation of isotope labeling, recent advances in sequencing technology mean that it is possible to obtain affordable and comprehensive amplicon profiles, metagenomes, or metatranscriptomes from SIP experiments. Not only can the abundance of microbial groups be inferred from metagenomes, but researchers can bin, assemble, and explore individual genomes to build hypotheses about the metabolic capabilities of labeled microorganisms. Analysis of labeled mRNA is a more recent advance that can provide independent metatranscriptome-based analysis of active microorganisms. The power of metatranscriptomics is that mRNA abundance often correlates closely with the corresponding activity of encoded enzymes, thus providing insight into microbial metabolism at the time of sampling. Together, these advances have improved the sensitivity of SIP methods and allow the use of labeled substrates at ecologically relevant concentrations. Particularly as methods improve and costs continue to drop, we expect that the integration of SIP with multiple omics-based methods will become prevalent components of microbial ecology studies, leading to further breakthroughs in our understanding of novel microbial populations and elucidation of the metabolic function of complex microbial communities. In this chapter we provide protocols for obtaining labeled DNA, RNA, and proteins that can be used for downstream omics-based analyses.

DNA -، RNA - و پروتئین - مبتنی بر پروتیین - Isotope Probing برای تحلیل biomarker High از Throughput فعال

probing Stable (SIP)محققان را قادر می‌سازد تا جمعیت‌های فعال درون جوامع میکروبی پیچیده را هدف قرار دهند، که با فراهم کردن لایه‌های رشد غنی‌شده با ایزوتوپ‌های سنگین، معمولا به شکل ۱۳ C، ۱۸ یا ۱۵ N به دست می‌آید. پس از رشد بر روی زیرلایه و استخراج subsequent میکروبی، معمولا اسیده‌ای نوکلییک یا پروتیین‌ها، تکنیک SIP برای بازیابی و تجزیه و تحلیل بیولوژیکی labeled از جمعیت‌های میکروبی فعال مورد استفاده قرار می‌گیرد. در سال‌های بعد از توسعه اولیه SIP و RNA - مبتنی بر DNA، این روش متداول برای مشخص کردن جمعیت‌ها با استفاده از آنالیز ژن مورد نظر بود. این رویکردها معمولا شامل تجزیه و تحلیل‌های مبتنی بر اثر انگشت یا توالی of حاوی ژن ۱۶ S rRNA یا ژن marker functional هستند. اگرچه انگشت‌نگاری مولکولی یک روش ارزشمند برای تایید سریع of ایزوتوپ است، پیشرفت‌های اخیر در فن‌آوری توالی به این معنی است که به دست آوردن پروفایل های amplicon و جامع affordable، metagenomes، یا metatranscriptomes از آزمایش‌ها SIP امکان پذیر است. نه تنها می توان تعداد زیادی از گروه‌های میکروبی را از metagenomes استنباط کرد، بلکه محققان می‌توانند ژنوم فردی را جمع‌آوری و کشف کنند تا فرضیاتی در مورد توانایی‌های متابولیک جانداران برچسب دار بسازند. تحلیل mRNA labeled یک پیشرفت جدیدتر است که می‌تواند تجزیه و تحلیل independent مبتنی بر metatranscriptome برای میکرو ارگانیسم‌های فعال فراهم کند. قدرت of این است که فراوانی mRNA اغلب با فعالیت مشابه آنزیم‌های کدگذاری شده مرتبط است، در نتیجه بینشی را در متابولیسم میکروبی در زمان نمونه‌گیری فراهم می‌کند. با این حال، این پیشرفت‌ها حساسیت روش‌های SIP را بهبود بخشیده و اجازه استفاده از لایه‌های برچسب دار در غلظت‌های مربوطه از نظر اکولوژیکی را می‌دهد. به خصوص وقتی که روش‌ها بهبود می‌یابند و هزینه‌ها کاهش پیدا می‌کنند، ما انتظار داریم که ادغام SIP با روش‌های مبتنی بر omics، مولفه‌های شایع مطالعات اکولوژی میکروبی باشد که منجر به پیشرفت‌های بیشتر در درک ما از جمعیت‌های میکروبی جدید و توضیح عملکرد متابولیک جوامع میکروبی پیچیده خواهد شد. در این فصل برای به دست آوردن DNA، RNA و پروتیین‌ها، پروتکل‌هایی برای به دست آوردن DNA، RNA و پروتیین‌ها فراهم می‌کنیم.

ترجمه شده با

Download PDF سفارش ترجمه این مقاله این مقاله را خودتان با کمک ترجمه کنید
سفارش ترجمه مقاله و کتاب - شروع کنید

95/12/18 - با استفاده از افزونه دانلود فایرفاکس و کروم٬ چکیده مقالات به صورت خودکار تشخیص داده شده و دکمه دانلود فری‌پیپر در صفحه چکیده نمایش داده می شود.