view in publisher's site

Directing a rational design of aptamer-based fluorescence anisotropy assay for sensitive detection of immunoglobulin E by site-specific binding study

Highlights•Probing aptamer-IgE binding by fluorescence anisotropy (FA) analysis.•A rational design of FA assays for IgE using specific site-labeled aptamer probe.•Single fluorescein (FAM) was labeled on individual nucleotides (e.g., A, C, and T).•Possible binding nucleotide sites on aptamer were identified by FA of affinity complex.•Use of aptamer with FAM at internal T10 site allowed a more sensitive FA assay.AbstractMapping aptamer-protein interactions is important for characterization and applications of aptamers against proteins. We describe here probing affinity interactions between aptamer and immunoglobulin E (IgE) with a fluorescence anisotropy (FA) approach using a series of aptamer probes having single fluorescein (FAM) label at individual nucleotide (A, C, T). Studies of binding between IgE and aptamer probes revealed several possible close-contact sites, e.g., T9, T10, T11, T13, C15, and T17 of a 37-nt aptamer with a stem-loop secondary structure. FAM labeling on these sites resulted in much higher FA values (higher than 0.230 for T10, T11, T13 and C15) of aptamer-IgE complexes than the distant sites (e.g., terminals) of aptamer probably because the bound IgE close to these sites significantly restricted local rotation of FAM. Close-contact site labeled aptamer probes with high affinity allowed to develop a more sensitive FA assay for IgE than distant site labeled aptamers. The FA assay using T10-labeled aptamer with a dissociation constant (Kd) about 0.8 nM enabled selective detection of IgE at 20 pM and large FA increase upon IgE addition. We also found A12, C14, A25, and T27 were important for IgE-aptamer binding as FAM labeling at these sites significantly reduced aptamer affinity. FA study showed the loop region of this stem-loop aptamer was crucial for affinity binding, and IgE bound to the loop. This FA method will be helpful for understanding aptamer-protein binding and making a rational design of aptamer affinity assays for proteins.Graphical abstractWe probe the aptamer-IgE binding by fluorescence anisotropy (FA) analysis using specific nucleotide-labeled aptamer with fluorescein (FAM). The aptamer with FAM label on the close-contact site shows higher FA value in aptamer-IgE complex than the distant site labeled aptamer. The use of the close-contact site labeled aptamer with high affinity allows to develop a more sensitive FA assay for IgE.Download : Download high-res image (198KB)Download : Download full-size image

هدایت طراحی منطقی سنجش ناهمسانگردی فلورسانس مبتنی بر آپتامر برای تشخیص حساس ایمونوگلوبین E با مطالعه اتصال ویژه سایت

کاره‌ای برجسته در حال انجام اتصال آپتامر - ایگی بوسیله آنالیز ناهمسانگردی فلورسانس (FA). طراحی منطقی سنجش FA برای ایگایی با استفاده از پروب آپتامر نشاندار شده با محل خاص. تنها فلورسانس (FAM)با نوکلیوتیدهای مجزا برچسب زده شد (به عنوان مثال A، C، T). جایگاه‌های نوکلیوتیدهای اتصال احتمالی روی اپتامر بوسیله FA کمپلکس میل ترکیبی شناسایی شدند. استفاده از آپتامر با FAM در سایت T۱۰ داخلی به FA حساس‌تر اجازه می‌دهد. ما در اینجا با استفاده از یک سری از پروب های اپتامر که دارای یک برچسب فلورسین (FAM)در نوکلیوتیدهای منفرد (A، C، T)هستند، فعل و انفعالات میل ترکیبی بین اپتامر و ایمونوگلوبین E را با یک روش ناهمسانگردی فلورسانس (FA)توصیف می‌کنیم. مطالعات اتصال بین پروب های ایگایی و اپتامر چندین محل تماس نزدیک ممکن را نشان داد، به عنوان مثال T۹، T۱۰، T۱۱، T۱۳، C۱۵، و T۱۷ از یک آپتامر ۳۷ بیتی با ساختار ثانویه حلقه بنیادی. نشاندارسازی FAM در این سایت‌ها منجر به مقادیر FA بسیار بالاتر (بالاتر از ۰.۲۳۰ برای T۱۰، T۱۱، T۱۳ و C۱۵)کمپلکس‌های اپتامر - ایگایی نسبت به سایت‌های دور (به عنوان مثال، ترمینال‌های)آپتامر شد احتمالا به این دلیل که ایگایی محدود به این سایت‌ها به طور قابل‌توجهی چرخش محلی FAM را محدود کرده‌است. محل تماس نزدیک پروب های اپتامر برچسب دار با تمایل بالا اجازه ایجاد یک سنجش FA حساس‌تر برای ایگایی نسبت به محل دور برچسب گذاری شده اپتامر را می‌دهد. سنجش FA با استفاده از آپتامر برچسب دار T۱۰ با ثابت تفکیک (Kd)در حدود ۰.۸ nM کشف انتخابی ۱۵E در ۲۰ pM را فعال می‌کند و FA بزرگ با اضافه شدن ۱۵E افزایش می‌یابد. ما همچنین دریافتیم که A۱۲، C۱۴، A۲۵، و T۲۷ برای اتصال ایگنایی - اپتامر مهم بودند به طوری که نشاندارسازی FAM در این سایت‌ها به طور قابل‌توجهی میل ترکیبی آپتامر را کاهش داد. مطالعه FA نشان داد که منطقه حلقه این اپتامر حلقه ساقه برای اتصال میل ترکیبی حیاتی بود، و ایگایی متصل به حلقه بود. این روش FA برای درک اتصال آپتامر - پروتیین و طراحی منطقی سنجش‌های میل ترکیبی آپتامر برای پروتیین‌ها مفید خواهد بود. آپتامر با برچسب FAM در محل تماس نزدیک مقدار FA بالاتری را در کمپلکس آپتامر - ایگئی نسبت به آپتامر برچسب دار دوردست نشان می‌دهد. استفاده از محل اتصال نزدیک برچسب گذاری شده با میل ترکیبی بالا اجازه می‌دهد تا یک تست FA حساس‌تر برای بار فنیل داون ایجاد شود: دانلود تصویر high - res (۱۹۸ کیلوبایت)دانلود: دانلود تصویر تمام اندازه
ترجمه شده با


پر ارجاع‌ترین مقالات مرتبط:

  • مقاله General Chemistry
  • ترجمه مقاله General Chemistry
  • مقاله شیمی عمومی
  • ترجمه مقاله شیمی عمومی
سفارش ترجمه مقاله و کتاب - شروع کنید

با استفاده از افزونه دانلود فایرفاکس چکیده مقالات به صورت خودکار تشخیص داده شده و دکمه دانلود فری‌پیپر در صفحه چکیده نمایش داده می شود.