view in publisher's site

Droplet-Based Pyrosequencing Using Digital Microfluidics

The feasibility of implementing pyrosequencing chemistry within droplets using electrowetting-based digital microfluidics is reported. An array of electrodes patterned on a printed-circuit board was used to control the formation, transportation, merging, mixing, and splitting of submicroliter-sized droplets contained within an oil-filled chamber. A three-enzyme pyrosequencing protocol was implemented in which individual droplets contained enzymes, deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs), and DNA templates. The DNA templates were anchored to magnetic beads which enabled them to be thoroughly washed between nucleotide additions. Reagents and protocols were optimized to maximize signal over background, linearity of response, cycle efficiency, and wash efficiency. As an initial demonstration of feasibility, a portion of a 229 bp Candida parapsilosis template was sequenced using both a de novo protocol and a resequencing protocol. The resequencing protocol generated over 60 bp of sequence with 100% sequence accuracy based on raw pyrogram levels. Excellent linearity was observed for all of the homopolymers (two, three, or four nucleotides) contained in the C. parapsilosis sequence. With improvements in microfluidic design it is expected that longer reads, higher throughput, and improved process integration (i.e., “sample-to-sequence” capability) could eventually be achieved using this low-cost platform.

pyrosequencing مبتنی بر Droplet با استفاده از Microfluidics دیجیتال

امکان اجرای شیمی pyrosequencing در قطرات با استفاده از microfluidics دیجیتال مبتنی بر electrowetting گزارش شده‌است. یک آرایه از الکترودها که بر روی یک صفحه چاپی طراحی شده‌بود برای کنترل تشکیل، حمل و نقل، ادغام، اختلاط و انشعاب قطرات ریز در داخل یک محفظه پر از نفت استفاده می‌شد. یک پروتکل سه آنزیم pyrosequencing در آن اجرا شد که در آن قطرات منفرد حاوی آنزیم‌ها، deoxyribonucleotide triphosphates (dntps)، و الگوهای DNA بودند. الگوهای DNA به دانه‌های مغناطیسی متصل شده بودند که آن‌ها را قادر می‌ساخت بین additions نوکلیوتیدی کاملا شسته شوند. reagents و پروتکل‌ها برای به حداکثر رساندن سیگنال بر روی پس‌زمینه، خطی بودن واکنش، بازده چرخه و راندمان شستشو بهینه شدند. به عنوان یک نمایش اولیه از امکان‌سنجی، بخشی از یک قالب parapsilosis از ۲۲۹ جفت بازی کاندیدا آلبیکنس با استفاده از یک پروتکل de و یک پروتکل resequencing تعیین توالی شد. پروتکل resequencing بیش از ۶۰ جفت بازی با دقت توالی ۱۰۰ % براساس سطوح pyrogram خام تولید کرد. خطی شدن عالی برای تمام of ها (دو، سه و یا چهار نوکلئوتید)در C. (p < ۰.۰۵). با بهبود طراحی microfluidic انتظار می‌رود که با استفاده از این پلت فرم کوتاه هزینه، توانایی خواندن، توان عملیاتی بالاتر، و یکپارچگی فرآیند بهبود یافته (یعنی "توانایی نمونه به توالی")را می توان در نهایت به دست آورد.

ترجمه شده با

Download PDF سفارش ترجمه این مقاله این مقاله را خودتان با کمک ترجمه کنید
سفارش ترجمه مقاله و کتاب - شروع کنید

95/12/18 - با استفاده از افزونه دانلود فایرفاکس و کروم٬ چکیده مقالات به صورت خودکار تشخیص داده شده و دکمه دانلود فری‌پیپر در صفحه چکیده نمایش داده می شود.